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Apr 29, 2023

Nature Chemical Biology volume 18、pages 385–393 (2022)この記事を引用

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メトリクスの詳細

無細胞バイオセンサーは、人間と環境の健康を監視するための強力なプラットフォームです。 ここでは、核酸鎖間のプログラム可能な相互作用を通じて分子計算を可能にする動的 DNA ナノテクノロジーであるトーホールド媒介鎖変位回路とそれらを接続することで、その機能を拡張します。 私たちは、ROSALIND と呼ばれる小分子センシング プラットフォームとトーホールド媒介鎖変位をインターフェースするための設計ルールを開発し、反応速度の微調整を可能にするハイブリッド RNA-DNA 回路を構築します。 これらの設計ルールを使用して、さまざまな論理関数 (NOT、OR、AND、IMPLY、NOR、NIMPLY、NAND) を実装する 12 の異なる回路を構築します。 最後に、検出される分子の濃度範囲をエンコードする一連のバイナリ出力を作成する、アナログ - デジタル コンバーターのように機能する回路を示します。 私たちは、この研究により、分子計算を使用してバイオセンサーの速度と実用性を向上させる「スマート」診断を作成するための道筋が確立されると信じています。

無細胞バイオセンシングは、人間と環境の健康に関連するさまざまな化合物を検出できる、低コストで使いやすく、現場で導入可能な診断技術プラットフォームとして台頭しています 1,2。 これらのシステムの中核は、RNA またはタンパク質ベースのバイオセンシング層とレポーター構築出力層の 2 つの層で構成されます。 これらの層を遺伝的に配線することにより、標的化合物がバイオセンサーに結合し、レポーターの発現を活性化するとシグナルが生成されます (図 1)。 反応は、これらの層を無細胞システム内に埋め込み、凍結乾燥することで組み立てられ、保管、輸送、必要な時点で目的のサンプルとの再水和が容易になります1,3。 このアプローチを使用して、無細胞バイオセンサーは、病原菌5からの亜鉛4やクオラムセンシング分子5、ガンマヒドロキシ酪酸6などの薬剤、フッ化物1、アトラジン2、抗生物質、重金属7などの水汚染物質7など、人間の健康に関連する化合物を検出することに成功しました。

(上) 無細胞バイオセンサーは通常、標的化合物 (入力) が、レポーター構築物 (出力層) の発現を活性化するように構成されたタンパク質転写因子 (センサー層) に結合すると活性化します。 これにより、蛍光などの検出可能なシグナルが生成されます。 (下) 信号生成の前に下流の情報処理層を追加すると、ロジック処理や信号比較などの計算機能を追加することで、セルフリー バイオセンサーの性能を向上させ、機能を拡張できます。 ここでは、これは、信号を生成するトーホールド媒介鎖変位回路を活性化できる一本鎖 RNA を生成するようにバイオセンシング出力層を配線することによって実装されます。

しかし、既存の無細胞バイオセンサーには、信号生成前にセンシング層からの応答を操作できる情報処理層が欠けていることがよくあります（図1）。 このような情報処理層は生物の自然な特徴であり、細胞がストレス反応を活性化し、発達を導き、細胞内および細胞外の合図に基づいて行動決定を下すことを可能にします8。 このため、ロジックとフィードバックを実装する遺伝情報処理層は、合成細胞システムで広範囲に活用され、設計されてきました9,10。 同様に、我々は以前、RNA ベースの回路を、RNA Output Sensors Activated by Ligand INDuction (ROSALIND) と呼ばれる無細胞バイオセンサー プラットフォームに追加して、タンパク質バイオセンサーを操作することなく、その特異性と感度を向上できることを示しました 7。 ただし、これらの回路は依然としてセンシング層または出力層のいずれかに直接作用するため、その機能を改善および拡張する能力は制限されています。

ここでは、インビトロで分子情報を処理できる強力な計算能力を持つ DNA ナノテクノロジーであるトーホールド媒介 DNA 鎖置換 (TMSD) を活用することで、ROSALIND の機能を強化および拡張するための一般化可能な情報処理層を開発します11。 TMSD では、一本鎖 DNA (ssDNA) 入力は、相補的塩基対相互作用を介して二本鎖 DNA の「ゲート」と鎖を交換し、ssDNA 出力鎖を生成します。 DNA ゲートを異なるネットワーク アーキテクチャに構成することで、一般的な化学計算アーキテクチャ 16 と同様に、信号復元 12、信号増幅 13、論理計算 14、15 などの一連の操作を実行できます。 DNA 塩基対形成の熱力学がよく特徴付けられているため、単純な構成要素から大規模なネットワークを構築できます。 さらに、鎖置換プロセスを開始する DNA ゲート内の一本鎖領域である「トーホールド」の強度を変更することで、反応速度を正確に調整することができます 17。 TMSD は、インビトロ発振器 18、触媒増幅器 19、自律分子モーター 20、21、および再プログラム可能な DNA ナノ構造 22、23 などの強力なデバイスの開発につながりました。 したがって、TMSD ベースの情報処理には、無細胞バイオセンサーを改善する大きな可能性があります。

TMSD 回路は、microRNA 24、25 やヒト病原体 26 などの核酸標的の検出に使用されてきましたが、現在、無細胞バイオセンサーでの使用を可能にする小分子で TMSD 回路をトリガーするための一般的な設計ルールはありません。 したがって、我々は、化学標的の結合事象を、TMSD カスケードを引き起こすことができる核酸鎖の変化に変換できるインターフェースを作成することを目指しました。 アロステリック転写因子 (aTF) は、化学標的の検出時にプログラム可能な RNA 配列の転写を活性化することにより、このインターフェースを自然に作成します。 しかし、aTF と TMSD 回路を組み合わせて in situ で機能させるには、RNA ポリメラーゼ (RNAP) と核酸ゲート間の干渉 27、RNA 媒介 TMSD 回路の実験的特性評価の欠如 28、RNA フォールディングを妨げる複雑さなど、大きな課題があります。 TMSD回路機能。

ここでは、ROSALIND7 のセンシング層と TMSD 回路を接続するための設計ルールを開発することで、これらの課題に対処します。 我々はまず、同じ反応内で T7 RNAP 駆動の in vitro 転写 (IVT) と TMSD を可能にするように新しい DNA シグナル ゲートの設計を最適化できることを示します。 次に、TMSD の反応速度を調整するための RNA 二次構造設計ルールを開発し、特に応答速度を向上させます。 また、この原理を応用して TMSD をいくつかの異なる aTF と結合させ、それらの同族リガンドに対するバイオセンサーを作成します。 次に、7 つの異なる論理関数 (NOT、OR、AND、NOR、IMPLY、NIMPLY、NAND) を実装する 12 の異なる回路を構築することで、プラットフォームのプログラマビリティを示します。 最後に、モデル駆動型アプローチを使用して、アナログ デジタル コンバーター (ADC) のように機能する多層 TMSD 回路を構築し、ターゲット分子の濃度範囲をエンコードする一連のバイナリ出力を作成します。 まとめると、この研究は、TMSD を使用して分子計算を実装し、セルフリー バイオセンサーの機能を拡張できることを示しています。

ROSALIND と TMSD を接続するために、我々はまず、一本鎖 RNA が DNA シグナルゲートを鎖置換できることを検証しようとしました。 我々は、以前の研究の DNA シグナル ゲートを変更して、3' 末端に 8 ヌクレオチドのトーホールドを備え、一方の鎖が蛍光団で標識され、もう一方の鎖がクエンチャーで標識されたゲートを作成しました (補足データ 1)29。 次に、侵入 RNA 鎖 (InvadeR) をフルオロフォア鎖に完全に相補的になるように設計し、クエンチャー鎖を鎖置換して蛍光出力を生成します。 精製したInvadeRをDNAシグナルゲートと組み合わせると、InvadeRなしの対照よりも蛍光の活性化が観察されました（補足図1および2a）。 このように、InvadeRは侵入ssDNA鎖（InvadeD）と同様に動作しましたが、InvadeRの滴定によりInvadeDよりも低い濃度で蛍光のプラトーが発生しました（補足図2a、b）。 特に、NUPACK30は、InvadeDの構造がInvadeRよりも不安定であり、InvadeRがそれ自体に結合して二重鎖を形成する可能性があり、これによりInvadeRの機能が阻害される可能性があると予測しています（補足図2c〜e、補足データ2および3）。

次に、DNAシグナルゲートの存在下でInvadeRがin situで転写されてシグナルを生成できるかどうかを調べました。 ROSALIND プラットフォーム設計に従って、高速で進行性のファージ ポリメラーゼである T7 RNAP を選択し、最小 17 塩基対 (bp) の T7 プロモーター配列とそれに続く 2 つの開始グアニンと InvadeR 配列で構成される DNA テンプレートを構成しました (補足データ) 1)。 我々は最初、T7 RNAPがDNAシグナルゲートのみから蛍光シグナルを生成できることを観察しました（拡張データ図1b）。 以前の報告27、31、32、33に基づいて、我々はT7 RNAPがDNAシグナルゲートの3'トゥーホールド領域から転写を開始し、鎖の変位とシグナル生成を引き起こしているという仮説を立てました（拡張データ図1a）。 この仮説を検証するために、DNAシグナルゲートの極性を反転して5'トーホールド末端を含めましたが、5'トーホールドDNAシグナルゲートからの蛍光シグナルは観察されませんでした（拡張データ図1b）。 各IVT反応からのRNA種の尿素-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（尿素-PAGE）分析でも、3'トーホールドDNAシグナルゲートとの反応からのみRNA副産物が示されました（拡張データ図1c）。 DNAシグナルゲート33の2'-O-メチル化によっても同様に偽の転写が排除されることを確認しました（拡張データ図1d–f）。

最適化された DNA シグナル ゲート設計により、次に TMSD を使用して、T7 RNAP 駆動の IVT によって生成された RNA 出力を in situ で追跡しました。 私たちは、迅速な信号生成のために InvadeR の設計を最適化することに重点を置きました。 補足図2の結果に基づいて、我々は、InvadeRの二次構造が、例えばトーホールド結合や鎖侵入を妨げることにより、TMSD効率において重要な役割を果たすであろうという仮説を立てた34,35。 この仮説を検証するために、それぞれ予測される安定性と 3' 末端の二次構造が異なる 5 つの異なる InvadeR 変異体を設計しました (図 2a)。 等モル量の各ゲル精製 InvadeR バリアントを DNA シグナルゲートに添加すると、蛍光シグナルの大きさが各バリアントの予測最小自由エネルギーに従って順序付けられることが観察されました (図 2b)。 さらに、各強化バージョンは、対応する非強化バージョンよりも大幅に低い蛍光を示しました。

a, InvadeR の 3 つの異なるバリアントが設計されました。 バリアント 1 には、2 つの開始グアニンと、それに続くフルオロフォア鎖に完全に相補的な配列が含まれます。 バリアント 2 および 3 では、開始グアニンと InvadeR 配列 (網掛け領域) の間に 2 つまたは 3 つの追加のヌクレオチドが挿入され、塩基の二次構造が破壊されます。 変異体 2 および 3 の強化バージョンは、挿入されたヌクレオチドの数と位置を一貫して保ちながら、構造を安定化するために作成されました。 すべての変異体は、DNA シグナル ゲートと相互作用する同じ数のヌクレオチドを持っています。 各構造の最小自由エネルギーと塩基対の確率は、37 °C で NUPACK を使用して予測されます30。 nt、ヌクレオチド。 b、ゲル精製したInvadeRバリアント（5μM）を等モル量のDNAシグナルゲートに添加し、蛍光活性化を定量化しました。 変異体 3 が最も高い蛍光シグナルを生成し、変異体 2 および 1 がそれ​​に続きますが、両方の強化変異体は、バーの上に示されている倍率減少によってそれぞれの変異体からのシグナルの減少を示します。 c. InvadeR をコードする DNA テンプレートが T7 RNAP および DNA シグナル ゲートに含まれている場合、シグナル ゲートからの蛍光活性化をモニタリングすることで RNA 出力をその場で追跡できます。 ｄ、等モルのＤＮＡ鋳型（５０ｎＭ）または鋳型なしの陰性対照を使用した、ＩＶＴからの３つの変異体の蛍光動態の比較。 e、f、バリアント 2 (e) とバリアント 3 (f) のバリアントとその強化変異体の蛍光動力学の比較は、塩基対の強化が蛍光動力学に悪影響を与えることを示しています。 示されているすべてのデータは、n = 3の独立した生物学的複製であり、それぞれがMEF（μMフルオレセイン）に標準化された生の蛍光を点（b）または線（d〜f）としてプロットしています。 b の各バーの高さは、これらの反復の平均を表します。 エラーバー (b) と陰影 (d – f) は、反復の平均値 ± sd を示します。

ソースデータ

次に、in situで転写された変異体のTMSD反応速度論をテストしました。 各 InvadeR バリアントをコードする 50 nM の DNA テンプレートを IVT 反応混合物に添加すると (図 2c)、以前の結果と一致して、バリアント 3 から最も速い蛍光活性化が観察され、続いてバリアント 2 と 1 (図 2d) が観察されました。実験。 また、強化されたバージョンからの応答が遅いことも観察され、仮説が再確認されました（図2e、f）。

しかし、定量的に予測された二次構造の安定性と反応速度論の間に不一致が観察されました。 具体的には、より低い最小自由エネルギー値を持つ強化されたバリアントは、バリアント 1 よりも速い反応速度とより高い終点蛍光値を示します（図 2d–f）。これは、図 2b で観察された結果と矛盾します。 我々は、RNA 二次構造が TMSD 応答速度に大きな影響を与えるものの、各 DNA テンプレートの T7 RNAP 転写効率の変化がこの不一致に寄与していることを発見しました 36 (拡張データ図 2)。 また、DNA テンプレートの最後に T7 ターミネーター配列を追加すると、大幅ではありませんが、反応がスピードアップすることもわかりました (補足図 3 および補足データ 3)。

これらの結果を総合すると、二次構造と転写効率の両方の考慮事項を InvadeR 設計原理に組み込むことで、反応速度を向上させることができることがわかります。

次に、TMSD 出力を使用する無細胞バイオセンサーを作成するために、InvadeR の転写を aTF で制御できるかどうかを決定しました。 これには、aTF 転写制御を可能にするために、T7 プロモーターと InvadeR 配列の間に aTF オペレーター配列を挿入する必要がありました。 我々は以前に、T7 プロモーター配列と aTF オペレーター配列の間の間隔が ROSALIND 反応における IVT の効率的な制御にとって重要であることを実証しました 7,37。 同様に、2 bp スペーサーは TetR なしで強力な TMSD シグナルを生成しますが、TetR によって制御されるとほぼベースラインレベルに減少することを発見しました（図 3a、b）。

ａ、ＩＶＴは、Ｔ７プロモーターの下流に配置されたオペレーター配列（ｔｅｔＯ）を介して精製ａＴＦ（ＴｅｔＲ）に結合するように構成されたテンプレートを用いてアロステリックに制御することができる。 2 bp 間隔の一連のスペーサーを構築して、InvadeR の転写を調節する TetR の能力に対するスペーサーの長さの影響を評価しました。 b, 調節されたプロモーター - オペレーター スペーサー バリアント (5 μM TetR ダイマー、50 nM DNA テンプレートあり) および調節されていない (TetR なし) のエンドポイント データ (1 時間)。 c. TetR 調節 IVT 反応の誘導は、TetR に結合して tetO への結合を妨げる同族リガンドである aTc の存在下で起こります。 これにより転写が進行し、TMSD を介した蛍光の活性化が起こります。 d、aTcによる用量反応。50 nM DNAテンプレートおよび5 μM TetRダイマーを用いて1時間で測定。 シグナルがバックグラウンドから区別できる最低リガンド濃度は、リガンドなし条件に対する両側不均一分散スチューデント t 検定を使用して決定され、P 値の範囲はアスタリスクで示されます (***P < 0.001、 **P = 0.001–0.01、*P = 0.01–0.05、5 μM aTc の正確な P 値 = 5.064 × 10−5)。 テストされたすべてのリガンド濃度の自由度とともに正確な P 値は、ソース データで見つけることができます。 x 軸は対数スケールであり、ソース データに示されているため、リガンドなし条件のデータは除外されました。 e, TMSDの出力速度はRNAアプタマーの出力速度よりも速い。 f、10μM aTcで誘導した場合のTetR調節InvadeR出力とアプタマー出力との間の蛍光動態の比較。 示されているすべてのデータは、n = 3 の独立した生物学的複製であり、それぞれが MEF (μM フルオレセイン) に標準化された生の蛍光値を点 (b、d) または線 (f) としてプロットしています。 エラーバー (d) と陰影 (f) は、反復の平均値 ± sd を示します。

ソースデータ

次に、2 bp スペーサーを使用して、TetR がその同族リガンドであるアンヒドロテトラサイクリン (aTc) で抑制解除され、InvadeR の転写が可能になるかどうかを決定しました (図 3c)。 それぞれ 50 nM DNA テンプレート、5 μM TetR ダイマー、および 5 μM DNA シグナルゲートを含む IVT 反応に、さまざまな濃度の aTc を添加すると、低マイクロモル量の aTc まで強力な抑制が観察され、最大の半分の誘導は 2.5 ～ 2.5 でした。 5μMのaTc（図3d）。

TMSD 反応の速度が速い 17 ため、我々は、InvadeR 出力のリガンド媒介誘導速度が、遅い発色団結合とミスフォールディングを受けやすい以前に使用されていた ROSALIND RNA アプタマー出力よりもはるかに速いのではないかという仮説を立てました 34,38,39 (図 2)。 3e)。 予想通り、InvadeR プラットフォームは 10 分以内に可視の蛍光を活性化することが観察され、これは RNA アプタマー プラットフォームよりも約 5 倍速いです (図 3f)。

全体として、これらの結果は、aTF ベースのバイオセンサーが TMSD 出力とうまく接続でき、反応速度の即時改善につながることを示しています。

次に、このシステムがさまざまなクラスの小分子を検出するために、aTF のさまざまなファミリーと互換性があるかどうかを判断しました。 TetR に加えて、MarR ファミリー 42 と SmtB/ArsR ファミリー 43 の代表的な aTF として、それぞれ TtgR40 と SmtB41 を選択しました。 各 aTF の同族オペレーター配列を T7 プロモーターの 2 bp 下流、InvadeR 配列のすぐ上流に配置しました (拡張データ図 3a-c)。 テトラサイクリンを使用して TetR 制御反応を誘導すると、約 10 分で目に見える強力で堅牢な蛍光シグナルが観察されました (拡張データ図 3d、g)。 同様に、TtgRの同族リガンドであるナリンゲニンをTtgR制御反応に添加すると、ナリンゲニンの存在下でのみ強力な蛍光活性化が再び見られました（拡張データ図3e、h）。 ただし、smtO 配列を導入すると、制御されていない反応であっても反応速度が大幅に遅くなります (拡張データ図 4c)。 興味深いことに、smtO 配列は InvadeR 配列と強力なヘアピンを形成すると予測されており (拡張データ図 4a)、図 2 の結果に基づくと、反応速度に影響を与える可能性があります。 反応速度論を改善するために、分子内 smtO:InvadeR フォールディングを防ぐ RNA 構造絶縁モジュールを設計しました (拡張データ図 4)。これにより、バックグラウンド シグナルが低い ZnSO4 の存在下で SmtB 制御反応のシグナル活性化が速くなることが示されました (拡張データ図 3f、i)。

まとめると、これらの結果は、RNA 設計戦略を使用して、TMSD 回路を備えた ROSALIND プラットフォームをモジュール式に拡張できることを示しています。

無細胞バイオセンサーとTMSDのインターフェースは、小分子入力に応じてプログラムされたタスクを実行できるモジュール式デバイスを設計する機会を提供します。 これは、TMSD 回路がタンパク質回路よりも単純な設計ルールを持ち 44、その動作を正確に予測する計算モデルが存在し 34、35、そして新しい一連の TMSD 回路設計ツールが存在するため、特に当てはまります 45、46。 そこで、これらの機能を活用して、ROSALIND 用の TMSD 情報処理層を作成しました。

まず、2 つの異なるリガンドをシステムへの入力として処理するための論理ゲートを設計および構築しました。 具体的には、核酸入力を検出する TMSD 論理ゲート、AND および OR の以前の設計を採用しました 12、14、15、46 (図 4)。 InvadeR とシグナル ゲートの間の中間層として機能する DNA OR ゲートを設計することで、OR ロジックを実装しました。 InvadeR の転写が化学リガンドによってトリガーされると、InvadeR は対応する DNA OR ゲートで TMSD を実行して ssDNA 出力鎖を放出し、その後 DNA シグナル ゲートに侵入してシグナルを生成することができます (図 4a および補足データ 4)46。 。 2 つの DNA OR ゲートは同じ出力ドメイン (緑色) を共有しますが、2 つの異なる aTF によって制御される InvadeR によって活性化されます。 これらのORゲートをDNAテンプレート、aTFおよびシグナルゲートと一緒に含めると、標的リガンドが存在しない場合を除き、高速シグナル生成が可能になりました（図4bおよび補足データ5）。 IVT および TMSD 反応を記述する一連の常微分方程式 (ODE) を使用して OR ゲートをモデル化すると (使用した ODE モデルの詳細については補足情報を参照)、実験の傾向と一致しました (拡張データ図 5a および補足データ 6)。

a, 2 入力 OR ゲートには、2 つの追加の DNA OR ゲートが含まれています。 いずれかのリガンドによって転写が活性化されると、InvadeR 鎖はそれぞれの DNA OR ゲートと反応して、DNA シグナル ゲートに侵入できるドメイン (緑色) を持つ出力鎖を生成します。 b. 2 入力 OR ゲートがテトラサイクリン、ZnSO4、またはその両方によって活性化されると、蛍光活性化が観察されます。 c. 2 入力 AND ゲートには、シグナル ゲートに相補的なトーホールドを明らかにするために、両方の InvadeR 鎖が出力鎖を解離することを必要とする DNA AND ゲートが含まれています。 熱力学ドライバー (赤で強調表示) やクランプ ドメインなどの設計機能が実装されており、リークを最小限に抑えて効率的な TMSD を促進します (拡張データ図 6)。 d. 2 入力 AND ゲートは、テトラサイクリンと ZnSO4 の両方が存在する場合にのみ蛍光を活性化します。 e、NOT ゲートには 2 つの DNA テンプレートが含まれます: 非制御 InvadeR テンプレートと aTF 制御インバーター テンプレート。 転写の際、aTF 調節インバーターは DNA シグナル ゲートに似たヘアピン構造を形成し、RNA NOT ゲートを作成します。 調節されていない InvadeR は、より多くの塩基対相互作用と DNA シグナル ゲート (赤) との塩基対の不一致のため、RNA NOT ゲートと反応す​​ることが好ましいです。 tetO 配列が RNA NOT ゲートに干渉するのを防ぐために、スペーサー配列が含まれています。 f, テトラサイクリン センサーを使用して実装すると、NOT ゲートはテトラサイクリンが存在しない場合に信号を生成します。 示されているすべてのデータは、n = 3 の独立した生物学的複製であり、それぞれが MEF (μM フルオレセイン) に標準化された生の蛍光値を伴う線としてプロットされています。 網掛けは複製の平均±sd を示します。同じ色のドメインは、AND ゲートを除き、同じ配列を共有します。オレンジ色で強調表示されたドメインは、TMSD 効率を向上させるために OR ゲートのオレンジ色のドメインから変更されています。 すべての核酸ゲートは、37 °C30 で NUPACK を使用して予測された二次構造に従って描画されます。 各ドメインの配列と各ゲートの成分の濃度は、それぞれ補足データ 4 と 5 にあります。

ソースデータ

次に、以前の AND ゲート設計 47 を適用して、RNA ベースの TMSD AND ゲートを設計しました。このゲートは、InvadeR 1 に相補的なドメイン 1 (青色)、InvadeR 2 に相補的なドメイン 2 (オレンジ色)、および DNA に相補的なドメイン 3 の 3 つのドメインで構成されます。信号ゲート（緑色）（図4cおよび補足データ5）。 InvadeR ストランドは、不適切な AND ゲート ドメインへの不要なトーホールド結合を最小限に抑えるために、異なるトーホールド シーケンスを持つように設計されました。 TetRおよびSmtBを使用したセンシング反応におけるこのアーキテクチャの実装では、最初はどの条件でも蛍光活性化が起こりませんでした（拡張データ図6b）。 TMSD 反応を促進するために、TMSD 熱力学ドライバーとして機能する AND ゲートにミスマッチを組み込みました 48 (拡張データ図 6a)。 熱力学ドライバーは InvadeR による信号活性化を示しましたが、InvadeR 1 のみの条件で実質的なリークが観察されました (拡張データ図 6c)。 このリークを軽減するために、AND ゲートのドメイン 3 にクランプと呼ばれる追加の設計機能を実装し、InvadeR 1 のみが存在する場合の部分的な TMSD を防止しました49。 クランプ長を7 bpに増やすことにより、シグナル生成にテトラサイクリンとZnSO4誘導性InvadeR鎖の両方を必要とするANDゲートを構築しました（図4d、拡張データ図5bおよび6e、および補足データ5）。

AND や OR を超えたより複雑な論理ゲートを構築するには、ターゲット リガンドの存在下で信号をブロックする NOT 回路が必要です。 シグナル反転を達成するために、DNAシグナルゲートからInvadeRを隔離できるRNA NOTゲートを設計しました（図4eおよび補足データ4）47、50。 InvadeR の RNA NOT ゲートへの結合を偏らせるために、次の 3 つの設計特徴を組み込みました。(1) DNA シグナル ゲートよりも RNA NOT ゲートのトーホールドが長くなります。 (2) RNA NOT ゲートのループ内の追加の塩基対形成。 (3) InvadeR と DNA シグナルゲート間の不一致 (赤で強調表示) (拡張データ図 6f–j)。 また、RNA NOTゲートとtetOオペレーターの間にスペーサー配列を設計し、tetO配列をNOTゲート配列から構造的に絶縁しました（図4e）。 これらの設計機能が実装されると、テトラサイクリンの存在下でシグナルの減少が観察されました (図 4f、拡張データ図 5c、および補足データ 5)。 テトラサイクリン誘導性 RNA NOT ゲートから配列がシャッフルされたコントロール テンプレートからはシグナル反転は観察されませんでした (拡張データ図 7a、b)。 同じ設計アーキテクチャを適用して、ZnSO4 誘導性 RNA NOT ゲートを構築しました（拡張データ図 5d、6k-m、7c、d、および補足データ 4 および 5）。

これらの結果は、より複雑な論理ゲート計算用のカスケード TMSD 回路を構築するための一連の設計ルールを確立します。

次に、NOR、NAND、IMPLY、NIMPLY などの複雑な論理計算を実行するために、基本的な論理コンポーネントを階層化しました。

私たちは、TetRまたはSmtBによってそれぞれ制御される2つのRNA NOTゲートを組み合わせることで、NOR（すべての入力が存在しない場合にのみシグナルを生成するORゲートの反転）から始めました（図5aおよび補足データ4）。 同じ構成的に発現されたInvadeRを隔離するように設計された両方のRNA NOTゲートを使用すると、両方のリガンド入力が存在しない場合にのみ蛍光活性化が観察されました（図5b、拡張データ図5e、および補足データ5）。

a, 2 入力 NOR ゲートは、2 つの RNA NOT ゲートを重ねて構築されます。 NOT ゲートは、制御されていない InvadeR 分子を DNA シグナル ゲートから隔離する TetR または SmtB によって制御されます。 b. 蛍光活性化は、両方の入力がない場合にのみ観察されます。 c. 2 入力 IMPLY ゲートは、DNA OR ゲートと RNA NOT ゲートを組み合わせます。 この特定の例 (ZnSO4 IMPLY テトラサイクリン) では、OR ゲートが TetR によって制御され、NOT ゲートが SmtB によって制御され、ZnSO4 のみの存在下でのシグナル生成が防止されます。 d, ZnSO4 のみを添加しない限り、蛍光活性化が観察されます。 テトラサイクリンのみの入力条件では、OR ゲート出力鎖とシグナル ゲートの間に不一致がないため、より高速なシグナル生成が観察されます。 e, 2 入力 NAND ゲートは、2 つの制御されていない DNA OR ゲートと 2 つの制御された RNA NOT ゲートを重ねます。 この構成では、信号生成を妨げるために両方の入力が存在する必要があります。 熱力学ドライバー (赤で強調表示) は、それぞれの InvadeR 鎖との相互作用を促進するために NOT ゲートに組み込まれています。 f, 期待された NAND ゲート計算が観察されます。 g, 2 入力 NIMPLY ゲートは、DNA AND ゲートと RNA NOT ゲートを組み合わせて構築されます。 この特定の例では、AND ゲートの活性化にはテトラサイクリン誘導性 InvadeR と制御されていない InvadeR が必要です。 SmtB で規制された NOT ゲートは、規制されていない InvadeR を隔離します。 h、蛍光活性化はテトラサイクリンのみの存在下で観察されます。 示されているすべてのデータは、n = 3 の独立した生物学的複製であり、それぞれが MEF (μM フルオレセイン) に標準化された生の蛍光値を伴う線としてプロットされています。 網掛けは、複製の平均 ± sd を示します。同じ色のドメインは、オレンジ色で強調表示されたドメインが OR ゲートのオレンジ色のドメインから変更されている AND ゲートを除き、同じ配列を共有します。 すべての核酸ゲートは、37 °C30 で NUPACK を使用して予測された二次構造に従って描画されます。 各ドメインの配列と各ゲートの成分の濃度は、それぞれ補足データ 4 と 5 にあります。

ソースデータ

次に、A が存在し、B が存在しない場合にのみ信号をブロックする A IMPLY B アーキテクチャに焦点を当てました。 ZnSO4 IMPLY テトラサイクリン ゲートは、テトラサイクリン誘導 DNA OR ゲートと ZnSO4 誘導 RNA NOT ゲートを重ねることで構築されました (図 5c および補足データ 4)。 実装すると、ゲートは、ZnSO4 のみが存在する場合を除くすべての入力条件で信号を生成しました (図 5d および拡張データ図 5f)。 ただし、InvadeR とシグナル ゲート (赤で強調表示) の間に組み込まれた不一致により、入力なしまたは両方の入力条件からの蛍光シグナルがテトラサイクリンのみの条件よりも遅くなり、より低くなり、同様の効果が観察されたことに注意してください。テトラサイクリン IMPLY ZnSO4 ゲートから (拡張データ図 5g および 7e、f)。 興味深いことに、IMPLYゲートはDNA ORゲートなしでも構築でき、これによりリガンド誘導性InvadeR鎖とシグナルゲート間の直接相互作用が可能になります（拡張データ図5h、i、および7g–j）。 同じ論理計算に対して代替ゲート アーキテクチャを設計できる機能は、プラットフォームのモジュール性を強調します。

次に、NOT ゲートと AND ゲートを組み合わせて、両方の入力が存在する場合を除くすべての条件で信号を生成する NAND ゲートを構築しました。 私たちは 2 つの設計オプションを検討しました。(1) AND ゲート出力ストランドの反転 (A NAND B = NOT (A AND B))。 (2) OR ゲート アーキテクチャに統合された 2 つの RNA NOT ゲート (NOT (A AND B) = NOT A OR NOT B)。 最初の設計オプションによって課されるシーケンス制約のため、2 番目のオプションを使用して NAND ゲートを構築することにしました (図 5e)。 この設計には、4 つの異なる DNA テンプレートが含まれます。2 つの非調節テンプレートは、それぞれ対応する DNA OR ゲートの InvadeR をコードし、2 つの調節テンプレートは、それぞれ、それぞれの InvadeR を隔離できる RNA NOT ゲートをコードします。 IMPLY ゲート設計で観察された TMSD 反応速度の低下を回避するために、代わりに RNA NOT ゲート (赤で強調表示) に熱力学ドライバーを導入し、DNA OR ゲートを使用した場合よりも RNA NOT ゲートを使用した InvadeR の TMSD を優先させました (図 1)。 5e)。 実装時には、信号の生成を防ぐためにテトラサイクリンと ZnSO4 の両方が必要でした (図 5f および拡張データ。図 5j)。

最後に、AND ゲートと NOT ゲートを組み合わせて、入力 A が単独で存在する場合にのみ出力を生成する A NIMPLY B ゲートを設計しました。 図5gに示す特定のNIMPLYゲート設計は、活性化に未制御のInvadeRとテトラサイクリン誘導InvadeRの両方を必要とするDNA ANDゲートと並行して、ZnSO4誘導RNA NOTゲートを使用します。 ZnSO4 NIMPLY テトラサイクリン ゲートとテトラサイクリン NIMPLY ZnSO4 ゲートは両方とも、予想された論理ゲート計算を実行しました (図 5h および拡張データ図 5k、l、および 7k)。

これらの結果を総合すると、基本的な論理ゲート コンポーネントを階層化して、システムへの入力として小分子を使用してより複雑な分子計算を実行できることがわかります。

TMSD 情報処理の実際の応用を実証するために、次にバイオセンサー出力の定量化に焦点を当てました。 典型的な無細胞バイオセンシングシステムでは、入力化合物濃度が検出閾値を超えると出力が生成され、この閾値に合わせて「存在/不在」結果の解釈が作成されます51。 この検出閾値は、aTF-リガンドと aTF-DNA 結合定数によって決まりますが、調整が難しい場合があります。 この制限に対処するために、ターゲット化合物のアナログ入力濃度をエンコードする一連のバイナリ出力を作成する ADC 回路 52 のようなシステムを設計しました (補足図 4)。

遺伝的 ADC 回路を構築するために、まずコンパレータ回路を作成しました。これは、入力が事前定義されたしきい値を超えたときに「True」バイナリ出力を生成する ADC の構成要素です。 TMSD では、DNA ゲート トゥホールド領域を長くすることで反応速度を正確に高めることができるため、閾値設定が可能です 17 (図 6a)。 この機能を使用して、DNAシグナルゲートと同じ配列を共有しますが、より長い8ヌクレオチドのトーホールドを備えた、標識されていないDNA閾値ゲートを構築しました（図6a）。 シグナルは閾値ゲートが完全に消費された後にのみ活性化されるべきであるため、閾値ゲートの量を調整することで、InvadeR がシグナルゲートからの蛍光を活性化する時間を正確に制御できると考えました。 この運動学的挙動をモデル化すると、これが実際にセットアップの予測された挙動であることが示され、モデル化予測との定量的な一致が実験的に観察されました（図6b）。 このように、閾値付き TMSD 反応は「動的」コンパレータ回路として機能します。特定の入力に対して、信号生成が発生する時間は閾値ゲートの量に比例します。

a. DNA ゲート トゥーホールド領域の長さを長くすると、鎖侵入プロセスをスピードアップすることができます。 より長いトーホールド (8 ヌクレオチド) を持つ標識されていない DNA ゲートは、InvadeR と優先的に反応し、プログラム可能な閾値として機能します。 InvadeR は、閾値ゲートが使い果たされた後にのみ、シグナル ゲート (4 ヌクレオチドのトーホールド) を鎖置換することができます。 b. 8 ヌクレオチドのトーホールド閾値ゲートを固定シグナル ゲート濃度 (0 ～ 8x) を超えてさまざまな比率で滴定すると、蛍光活性化に時間遅延が生じます。これは ODE シミュレーションで定量的にモデル化できます (点線)。 n = 3 の独立した生物学的複製のすべてのデータが線としてプロットされています。 生の蛍光値は、最初に MEF (μM フルオレセイン) に標準化され、シミュレーションとの比較に対応するためにすべての条件の最大 MEF に正規化されました (使用した正規化方法については「方法」を参照)。 網掛けは、反復の平均±sd c を示します。分子 ADC 回路は、各テストが異なる濃度の DNA 閾値ゲートを含む、同じセンサーのテストのストリップを構築することによって作成されます。 閾値ゲート濃度が高くなると、蛍光を活性化するためにより高いリガンド濃度が必要になります。 同じサンプルが各チューブに適用されると、ユーザーは、活性化する一連のチューブ (バイナリデジタル出力) を識別することにより、サンプル中に存在するリガンドの濃度に関する半定量的な情報 (アナログ入力) を取得できます。 ここでは、目に見えるしきい値が示された値の近くにあるため、MEF 値が 0.5 を超えるチューブを「ON」と定義します。 d、e、ODEシミュレーション（d）およびSmtB制御亜鉛センサーを使用して生成された100分のエンドポイント実験データ（e）を使用した亜鉛の分子ADC回路の特性評価。 ヒートマップ上の値は、n = 3 の独立した生物学的複製の平均 MEF (μM フルオレセイン) を表します (すべてのデータについては拡張データ図 8 を参照)。

ソースデータ

次に、各チューブに異なる量の閾値ゲートが含まれる一連の反応を準備することで、リガンド濃度の ADC として機能する一連のバイオセンシング TMSD コンパレータ回路を作成しました。 同じリガンド濃度を各チューブに加えることで、ユーザーは一連のチューブのどのチューブが特定の時点で活性化されるかを観察し、リガンド濃度に関する半定量的な情報を得ることができます（図6c）。 我々は、図6bで使用したのと同じODEのセットにaTF-DNAおよびaTF-リガンドの結合速度論を追加し、都市水道との関連性から亜鉛センシングに焦点を当てて、アプローチの実現可能性をテストしました53。 モデリングシミュレーションを使用して、それぞれ2、3.5、5、および10μMの亜鉛濃度に対応する100分後に1、2、3、または4本のチューブを活性化するのに必要な閾値ゲート濃度を決定しました（図6d）。 次に、SmtB制御TMSD反応を使用して対応する遺伝的ADC回路を構築し、100分後に予想される信号のパターンを確認しました。そこでは、入力ZnSO4濃度が高くなるにつれて、シリーズ内の活性化されたチューブの数が増加しました（図6eおよび拡張データ図）。 8a–d)。 この実装により、ユーザーは一連の活性化されたチューブを直接読み取って、入力亜鉛濃度範囲を決定できます。

この実証は、TMSD回路が無細胞バイオセンサーの情報処理層として機能し、出力信号の解釈と情報内容を向上させる可能性を示すものであると我々は考えています。

この研究では、TMSD 回路を IVT と接続して、セルフリー バイオセンサーの情報処理層として機能できることを示します。 TMSD出力の速度により、信号生成速度が大幅に向上し、検出までの時間が10分未満になりました（図3f）。 さらに重要なことは、ROSLIND のシンプルで明確な性質と TMSD の計算能力を組み合わせることで、複数の RNA-DNA ゲートを重ねて、7 つの異なる論理関数をモジュール形式で実装する 12 の異なる回路を構築できることがわかりました (図 4 および図 4)。 5)。 このプラットフォームの高いプログラム可能性を利用して、サンプル内の未知の標的化合物の濃度範囲を推定できる回路も設計および検証しました (図 6)。 最後に、このプラットフォームは凍結乾燥に適しており (拡張データ図 9)、未処理の現実世界のサンプル マトリックスでも機能します (拡張データ 図 10)。

このシステムには、T7 RNAP 駆動の IVT 反応と DNA ゲートの 3' トゥーホールドの不適合性 (拡張データ図 1)45、TMSD を遅らせる可能性がある RNA 二次構造の干渉 (図 2 および拡張データ図) など、多くの設計上の課題がありました。 .4)、および異なる DNA テンプレートのさまざまな T7 転写効率 36 (拡張データ図 2)。 これらの課題は、他の核酸工学システムに一般化できると考えられるRNAベースのTMSD設計原理を開発する機会を提供しました（補足図5）。

このプラットフォームの主な制限の 1 つはコストです。 精製を伴う化学修飾オリゴのコストは約 100 米ドル以上になる可能性がありますが、1 つのバッチで何百もの反応を行うことができます。 さらに、DNA ゲートは多くの場合、ハイブリダイゼーション後にゲル精製して未結合の ssDNA 鎖を除去する必要があり、これには時間と労力がかかる場合があります。 ただし、蛍光活性化 RNA アプタマー レポーティング システムの化学色素のコストは無視できないものであり、応答速度や計算能力の向上など TMSD システムによってもたらされる利点がその限界を上回っていることに注意します。

この研究の主な特徴は、TMSD 回路が情報処理層として機能することで無細胞バイオセンサーの機能を拡張する可能性を実証したことです。 最近、エンドヌクレアーゼ媒介 TMSD カスケードを通じて aTF ベースのバイオセンシングと TMSD を連携させるアプローチが開発されました 54 が、単純な汚染物質検出を超えるプログラム可能な分子計算は提示されていませんでした。 デモンストレーションとして、DNA ベースの TMSD 論理ゲートのいくつかの要素を適応させることにより、低分子入力で複雑な論理ゲート計算を実行できる複数の層の RNA ベースの TMSD 回路をモデル化、設計、検証しました (図 4 と 5、および拡張データ図) .5～7）。 図示されていませんが、追加のゲートを積層することで、XOR や XNOR などのより複雑な論理回路を設計できます。

プラットフォームの情報処理能力をさらに強調するために、入力リガンド濃度を半定量レベルで推定するために使用できる遺伝的 ADC 回路を開発しました (図 6)。 特に、この回路は閾値計算を使用して、入力分子濃度のアナログ信号を活性化されたチューブの数のデジタル出力に変換します。 この開発は、トーホールドの長さに基づいて TMSD の反応速度を正確に調整できる機能によって可能になりました。 ただし、この遺伝的 ADC 回路は、厳密な入力濃度ではなく閾値反応速度に依存するため、結果が活性化レベルではなく活性化時間に依存するという点で電気 ADC 回路とは異なることに注意してください。 結果として、この戦略は、出力動態の違いを引き起こすリガンド濃度を区別するのに最適です（拡張データ図8e-g）。

私たちは、このプラットフォームが無細胞システムにおける他のタイプの分子計算への扉を開くと信じています。 たとえば、触媒ヘアピン アセンブリ 55 などの増幅回路を TMSD を備えた ROSALIND に適用して、信号を増幅し、センサーを超高感度にすることができます。 しきい値処理を超えて、DNA シーソー ゲート アーキテクチャで実証されている他の操作を、さまざまな計算のためにこのプラットフォームに移植することができます 46。 具体的には、論理ゲートを拡張して、aTF リガンドの不規則性を修正するための一般的な戦略を開発できます 7。 さらに、in vitro 環境で機能する実質的にすべての aTF を使用できるため 7、異なるレポーターを備えた複数の DNA ゲートを多重化のために追加できます。 ADC 回路がアナログ電子回路とデジタル電子回路のインターフェイスで果たす基本的な役割は、生化学反応に追加の電子回路設計を採用する可能性も秘めています。

まとめると、これらの結果は、小分子バイオセンシングとTMSD回路の間のインターフェースを確立することが、無細胞バイオセンシング技術の機能を強化および拡張するための一般的な分子計算プラットフォームの作成に向けた有望な第一歩であることを示しています。

大腸菌株 K12 (NEB Turbo Competent E. coli、New England Biolabs、カタログ番号 C2984) を日常的なクローニングに使用しました。 大腸菌株ロゼッタ 2(DE3)pLysS (Novagen、カタログ番号 71401) を組換えタンパク質の発現に使用しました。 適切な抗生物質 (100 μg ml-1 カルベニシリン、100 μg ml-1 カナマイシンおよび/または 34 μg ml-1 クロラムフェニコール) を添加したルリア ブロスを増殖培地として使用しました。

この研究で使用された DNA シグナル ゲートは、Integrated DNA テクノロジーによって修飾オリゴとして合成されました。 これらは、6-カルボキシフルオレセイン (6-FAM) 修飾オリゴヌクレオチドと相補的なアイオワ ブラック FQ クエンチャー修飾オリゴヌクレオチド (補足データ 1) を 95℃ で 3 分間別々に変性し、ゆっくり冷却 (-0.1 ℃ s-1) することによって生成されました。アニーリングバッファー（100 mM 酢酸カリウムおよび 30 mM HEPES、pH 8.0）中で室温まで。 アニールしたオリゴヌクレオチドを 20% ネイティブ PAGE-トリス-ホウ酸-EDTA (TBE) ゲルで分離し、予想されるサイズのバンドを単離し、アニーリングバッファー中 4 °C で一晩溶出することで精製しました。 次に、溶出した DNA ゲートをエタノール沈殿し、MilliQ 超純水に再懸濁し、Thermo Scientific NanoDrop One 微量紫外可視分光光度計を使用して濃度を定量しました。 図1および2で使用されるDNAゲートは次のとおりです。 図 4～6 および拡張データ 図 6 および 7 は、同じ方法を使用して、ただし変更を加えずに 2 つの相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングすることによって調製されました。

クローニングおよび配列決定用の DNA オリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies によって合成されました。 aTFをコードする遺伝子は、gBlock（Integrated DNA Technologies）または遺伝子フラグメント（Twist Bioscience）として合成されました。 タンパク質発現プラスミドは、Gibson Assembly (NEB Gibson Assembly Master Mix、New England Biolabs、カタログ番号 E2611) を使用して pET-28c プラスミド骨格にクローニングされ、C 末端 His タグ融合体として組換えタンパク質を過剰発現するように設計されました。 SmtBを発現するための構築物には、TEVプロテアーゼを使用したHisタグの切断および除去のための認識配列がさらに組み込まれていました。 Gibson で組み立てた構築物を NEB Turbo 細胞に形質転換し、単離したコロニーをプラスミド DNA 用に精製しました (QIAprep Spin Miniprep Kit、Qiagen、カタログ番号 27106)。 プラスミド配列は、補足データ 1 にリストされているプラ​​イマーを使用して、サンガー DNA シークエンシング (Quintara Biosciences) で検証されました。

すべての転写テンプレートは、次の 2 つの方法のいずれかを使用して生成されました。 (1) T7 プロモーター、オプションの aTF オペレーター部位、 InvadeR コード配列とプライマー セットを使用するオプションの T7 ターミネーター。 または（２）Ｔ７プロモーター、任意のａＴＦオペレーター部位、ＩｎｖａｄｅＲまたはＲＮＡ ＮＯＴゲートコード配列を含む２つの相補的オリゴヌクレオチドのアニーリング。 この研究で使用されるすべてのオリゴおよびプライマーセットは補足データ 1 にリストされています。ここでは、転写される最初の G を除く最小 17 bp 配列 (TAATACGACTCACTATA) として T7 プロモーターを定義します。 PCR 増幅したテンプレートを精製し (QIAquick PCR 精製キット、Qiagen、カタログ番号 28106)、2% トリス-酢酸-EDTA-アガロースゲル上で予想サイズの単一の DNA バンドの存在を確認しました。 2 つの相補的オリゴをアニーリングすることによって生成されたテンプレートは、「DNA ゲートの準備」に記載されているのと同じ方法を使用して準備および精製されました。 すべての DNA テンプレートの濃度は、Qubit dsDNA BR アッセイ キット (Invitrogen、カタログ番号 Q32853) を使用して測定されました。

すべてのプラスミドと DNA テンプレートは、使用するまで 4 °C で保存されました。 この研究で生成されたすべてのプラスミドとオリゴの配列とAddgeneアクセッション番号をリストしたスプレッドシートは、補足データ1にリストされています。

精製オリゴ結合アッセイに使用した InvadeR バリアントは、以下の成分を使用して、InvadeR 配列の 3' 末端にあるシス切断 D 型肝炎リボザイムをコードする転写テンプレートから、37 °C で一晩 IVT によって最初に発現されました。 40 mM Tris-HCl pH 8、8 mM MgCl2、10 mM ジチオスレイトール、20 mM NaCl および 2 mM スペルミジン)、11.4 mM NTP pH 7.5、0.3 単位 (U) の熱安定性無機ピロホスファターゼ (New England Biolabs、カタログ番号 M0296S) 、100 nM 転写テンプレート、50 ng の T7 RNAP、および MilliQ 超純粋 H2O を加えて総量 500 μl にします。 次に、一晩の IVT 反応物をエタノール沈殿させ、20% 尿素-PAGE-TBE ゲルで分離して精製し、予想されるサイズ (26 ～ 29 ヌクレオチド) のバンドを単離し、MilliQ 超純水中 4 °C で一晩溶出させました。 溶出した InvadeR バリアントをエタノール沈殿し、MilliQ 超純水に再懸濁し、Qubit RNA BR Assay Kit (Invitrogen、カタログ番号 Q10211) を使用して定量し、使用するまで –20 °C で保存しました。 使用した D 型肝炎リボザイム配列は補足データ 1 にあります。

aTF は前述のように発現および精製されました 7。 簡単に説明すると、配列検証済みの pET-28c プラスミドを Rosetta 2(DE3)pLysS E. coli 株に形質転換しました。 細胞培養物 (1 ～ 2 L) を Luria ブロス中で 37 °C で増殖させ、0.5 mM のイソプロピル-β-d-チオガラクトシドを用いて光学密度 (600 nm) ～ 0.5 で誘導し、37 ℃でさらに 4 時間増殖させました。 ℃。 次に、培養物を遠心分離によってペレット化し、-80 °C で保存するか、溶解バッファー (10 mM トリス-HCl pH 8、500 mM NaCl、1 mM トリス(2-カルボキシエチル) ホスフィン (TCEP) およびプロテアーゼ阻害剤 (完全) に再懸濁しました)精製には EDTA フリーのプロテアーゼ阻害剤カクテル、Roche)) を使用します。 次いで、再懸濁した細胞を氷上で超音波処理により溶解し、不溶性物質を遠心分離により除去した。 次に、TetR を含む清澄上清を、Ni-NTA カラム (HisTrap FF 5 ml カラム、GE Healthcare Life Sciences) を使用した His タグ アフィニティー クロマトグラフィー、続いてサイズ排除クロマトグラフィー (Superdex HiLoad 26/600 200 pg カラム、GE Healthcare Life) を使用して精製しました。 Sciences) A​​KTAxpress 高速タンパク質液体クロマトグラフィー システムを使用。 ＴｔｇＲおよびＳｍｔＢを含む清澄上清を、Ｎｉ－ＮＴＡアガロース（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号３０２１０）を充填した重力カラムを用いたＨｉｓタグアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製した。 高速タンパク質液体クロマトグラフィー (TetR の場合) または重力カラム (TtgR および SmtB の場合) からの溶出画分を濃縮し、バッファー交換 (25 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、1 mM TCEP、50% グリセロール v/v) ）遠心濾過（Amicon Ultra-0.5、Millipore Sigma）を使用。 タンパク質濃度は、Qubit Protein Assay Kit (Invitrogen、カタログ番号 Q33212) を使用して測定しました。 タンパク質の純度とサイズは、SDS-PAGE ゲル (Mini-PROTEAN TGX および Mini-TETRA セル、Bio-Rad) で検証されました。 精製されたタンパク質は –20 °C で保存されました。

自家製 IVT 反応は、最終濃度でリストされている以下の成分を加えてセットアップしました: IVT バッファー (40 mM Tris-HCl pH 8、8 mM MgCl2、10 mM ジチオスレイトール、20 mM NaCl および 2 mM スペルミジン)、11.4 mM NTPs pH 7.5 、０．３Ｕの熱安定性無機ピロホスファターゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｍ０２９６Ｓ）、転写テンプレート、ＤＮＡゲートおよびＭｉｌｌｉＱ超純水を総量２０μｌに加えた。 調節された IVT 反応には、指定された濃度の精製 aTF がさらに含まれており、37 °C で約 10 分間平衡化されました。 プレートリーダー測定の直前に、2 ngのT7 RNAP、および必要に応じて、示された濃度のリガンドを反応液に添加しました。 次いで、「プレートリーダー定量化およびマイクロモル当量フルオレセインの標準化」に記載されているように、プレートリーダー上で反応を特徴付けした。

拡張データ図のゲル画像に示されている RNA 製品については、 1c、f、および 2c では、IVT 反応を最初に上記のように設定しました。 次に、フェノール-クロロホルム抽出とそれに続くエタノール沈殿を実行して、タンパク質を除去しました。 次に、反応液を 2 U の TURBO DNase (Invitrogen、カタログ番号 QAM2238) を含む 1× TURBO DNase バッファーで総量 20 μl になるまで再水和し、37℃ で 30 分間インキュベートして DNA ゲートと転写テンプレートを除去しました。 。 フェノール - クロロホルム抽出とその後のエタノール沈殿を再度実行して DNase を除去し、MilliQ 超純水で再水和しました。 抽出された RNA 産物の濃度は、Qubit RNA HS アッセイ キット (Invitrogen、カタログ番号 Q32852) を使用して測定され、PAGE などのさらなる分析まで -20 °C で保存されました。 これらの抽出された RNA 産物の PAGE 分析には、20% 尿素 – PAGE – TBE ゲルが使用され、ゲルは ChemiDoc Touch Gel Imaging System (Bio-Rad Image Lab Touch ソフトウェア v.1.2.0.12) を使用して画像化されました。

凍結乾燥する前に、PCR チューブのキャップにピンで穴を開け、3 つの穴を作成しました。 次に、50 mM スクロースおよび 250 mM d-マンニトールを添加して IVT (上記) の成分を組み立てることにより、ROSALIND 反応の凍結乾燥を実行しました。 組み立てた反応チューブをすぐに予冷したアルミニウムブロックに移し、-80 °C の冷凍庫に 10 分間入れてゆっくりと凍結させました。 ゆっくりと凍結した後、反応チューブをキムワイプとアルミホイルで包み、液体窒素に浸し、FreeZone 2.5 L ベンチトップ凍結乾燥システム (Labconco) に移し、冷却器温度 –85 °C で一晩凍結乾燥しました。圧力は0.04ミリバール。 すぐに再水和しない限り、凍結乾燥反応物は次のように包装されました。 反応物を乾燥剤 (Dri-Card Desiccants、Uline、カタログ番号 S-19582) の入った真空密閉可能なバッグに入れ、アルゴン キャニスター (ArT Wine Preserver、Amazon、カタログ番号 8541977939) を使用してアルゴンでパージし、すぐに乾燥させました。真空シール (KOIOS 真空シーラー機、アマゾン、カタログ番号 TVS-2233)。 次に、真空シールした袋を遮光袋 (マイラー オープンエンド フード バッグ、Uline、カタログ番号 S-11661) に入れ、ヒートシールしました (Metronic 8 インチ インパルス バッグ シーラー、Amazon、カタログ番号 8541949845) ）使用するまで涼しい日陰の場所に保管してください。

国立標準技術研究所の追跡可能な標準（Invitrogen、カタログ番号 F36915）を使用して、任意の蛍光測定値をマイクロモル相当のフルオレセイン（MEF）に変換しました。 50 μM ストックからの段階希釈物を、100 mM ホウ酸ナトリウム緩衝液ブランクを含む、pH 9.5 の 100 mM ホウ酸ナトリウム緩衝液で調製しました（合計 12 サンプル）。 各濃度について、サンプルの 9 つの複製を 3 つのバッチで作成し、6-FAM (フルオレセイン) 活性化蛍光の場合は 495 nm の励起波長と 520 nm の発光波長、または 520 nm の励起波長で蛍光値を読み取りました。プレートリーダー (Synergy H1、BioTek Gen5 v.2.04) での 3 ウェイ ジャンクション二量体ブロッコリー (3WJdB) 活性化蛍光の場合は 472 nm、発光波長は 507 nm。 単一の複製がプレートリーダーを飽和させるフルオレセイン濃度の蛍光値は、分析から除外されました。 次に、残りの複製 (サンプルあたり 9 個) を各フルオレセイン濃度で平均し、ブランクの平均蛍光値をすべての値から差し引きました。 次に、任意の単位で測定された蛍光値とフルオレセインの濃度の間の蛍光の直線範囲内の濃度 (0 ～ 3.125 μM フルオレセイン) について線形回帰を実行し、変換係数を特定しました。 各プレートリーダー、励起、発光およびゲイン設定について、任意の蛍光値を MEF に相関させるために使用される線形変換係数を見つけました (補足図 1 および補足データ 3)。

特性評価のために、マルチチャンネルピペットを使用して反応液 19 μl を 384 ウェルの光学的に透明な平底プレートにロードし、プレートシールで覆い、プレートリーダー (Synergy H1、BioTek Gen5 v.2.04) で測定しました。 6-FAM (フルオレセイン) 活性化蛍光の動態解析は、37 °C で 2 時間、それぞれ 495 nm と 520 nm の励起波長と発光波長で 1 分間隔でプレートを読み取ることによって実行されました。 3WJdB活性化蛍光の速度論的分析は、37℃で4時間、それぞれ472nmと507nmの励起波長と発光波長で3分間隔でプレートを読み取ることによって実行されました。 次に、任意の蛍光値を、適切な校正変換係数で除算することによって MEF に変換しました。

図6bのデータを除き、反応からの出力を分析する際にバックグラウンドの減算は実行されませんでした。 この標準化手順の例を補足図 1 に示します。

図6bに示すデータは上記のように生成され、実験観察とODEシミュレーションを比較するために次の方法を使用して正規化されました。 生の蛍光値は、まず上記の方法を使用して MEF (μM フルオレセイン) に標準化されました。 次に、実行したすべての反応 (5 条件 × 3 反復 = 15 反応) の間で最大 MEF 値を決定しました。 次に、次の式を使用して、時間間隔ごとの各 MEF 値を正規化しました。

消光された DNA シグナル ゲートで観察されたゼロ以外の蛍光を考慮するために、バックグラウンドの減算を実行しました。 上記の式に従ってすべてのデータが正規化されたら、条件ごとに n = 3 回の反復を平均し、条件ごとに対応する標準偏差値を計算しました。

トリミングされていない未処理のゲル画像は、補足図2dおよび拡張データ図に示されています。 1c、f、および 2c は、ソース データまたは補足データ 2 として利用可能であり、Mendeley Data (https://doi.org/10.17632/hr3j3yztxb.1) に保管されています。 拡張データ図 2c の SYBR 金染色尿素 – PAGE ゲルからのバンド強度は、前述の伝統的なレーン プロファイル法を使用して Fiji – ImageJ で計算されました 56。 簡単に言うと、すべてのレーンの関心領域が、同じ寸法の長方形を使用して登録されました。 次に、各ピークの底に直線を引くことで不均一なバックグラウンドを考慮し、ワンド ツールを使用して各レーンのピーク面積を計算しました。 次に、RNA 標準のピーク面積をロードした総量に対してプロットして、拡張データ図 2d の標準曲線を作成しました (直線範囲: 0.25 ～ 2 ng)。 標準曲線からの変換係数を使用して、ワンド ツールから得られたピーク面積値から InvadeR 変異体の濃度を推定しました。

イリノイ州エヴァンストンの ZnSO4 を添加した水道水の場合、約 50 ml の水サンプルが入った 2 本のボトルを水飲み場から収集しました。 次に、ボトルの 1 つを、Steriflip-GP 滅菌真空濾過システム (Millipore Sigma、カタログ番号 SCGP00525) を使用して 0.22 μm で濾過しました。 濾過した水サンプルと濾過していない水サンプルの両方に、2 M ZnSO4 溶液ストック (Sigma、カタログ番号 83265) から希釈した 10、1、または 0.1 mM ZnSO4 溶液を使用してスパイクしました。 再水和後、プレートリーダーを使用して反応の蛍光測定を実行しました（「プレートリーダーの定量化とMEF標準化」を参照）。 イリノイ州エヴァンストンの ZnSO4 を添加したミシガン湖水については、同じサンプリング方法を適用しました。

各反応種の ODE は、aTF 結合、IVT、および TMSD 反応速度論を使用して導出されました。 ODE は、Python v.3.7.6 の Scipy.Integrate パッケージの ODE ソルバー関数 odeint を使用して計算されました。 速度論的パラメーターは文献から推定され、初期条件は実験条件に設定され、中間体種はゼロに設定されました。 ODE シミュレーションの詳細については、補足情報で説明されています。

実行された反復の数と反復の種類は、各図の凡例に記載されています。 個々のデータ ポイントが表示され、関連する場合は平均 ± SD が表示されます。 この情報は各図の凡例に記載されています。 図 3d および拡張データ図 3 で実行される統計分析の種類は、各図の凡例に説明されています。 統計解析から計算された正確な P 値と自由度は、ソース データで確認できます。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

このペーパーに記載されているすべてのデータは、ソース データおよび補足データとして利用できます。 すべてのソース データと補足データ 2 および 3 も、Mendeley データ (doi: 10.17632/hr3j3yztxb.1) に保管されています57。 この論文で使用されているすべてのプラスミドは、Addgene で識別子 140371、140374、140391、および 140395 で入手できます。ソース データはこの論文に提供されています。

拡張データ図 5、拡張データ図 8、図 6 で使用される Python コードを含む Jupyter Notebook ファイルは補足データ 6 として提供され、この論文で使用される ODE モデルは補足情報で説明されています。 Python コードは、GitHub (https://git.io/Jtlh1) でも入手できます (参考文献 58)。

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この研究で使用した実験試薬と装置を管理してくれた A. Thompson (Northwestern University) と C. Knopp (Northwestern University) に感謝します。 J. Hester (ノースウェスタン大学)、A. Curtiss (ノースウェスタン大学)、および J. Mamish (ノースウェスタン大学) には、ADC 回路アーキテクチャに関する有益な議論を提供していただきました。 S. Schaffter (国立標準技術研究所) には原稿編集と TMSD 回路に関する有益な議論をしていただきました。 J. Peruzzi (ノースウェスタン大学)、NanoDrop 測定の支援について。 S. Pshenychnyi (ノースウェスタン大学の組換えタンパク質生産コア) にタンパク質精製の支援をしていただきました。 JKJ は、バイオテクノロジートレーニングプログラムと提携しているノースウェスタン大学のバイオテクノロジー、システム、および合成生物学の大学院クラスター、ライアンフェローシップ、およびマコーミック工学部ターミナルイヤーフェローシップによって一部支援されました。 CMA は、国防科学工学大学院 (NDSEG) フェローシップ プログラムを通じて国防総省から支援を受けました。 この研究は、NSF CAREER (1452441 to JBL)、NSF MCB RAPID (1929912 to JBL)、ノースウェスタン大学ユダヤ・イスラエル研究クラウン・ファミリー・センター (JBL) およびシカゴ・コミュニティーのサール基金からの資金提供によっても支援されました。 （JBLに）信頼してください。

米国イリノイ州エバンストン、ノースウェスタン大学化学生物工学部

ジェヨン・K・ユング、クロエ・M・アーチュレッタ、ジュリアス・B・ラックス

合成生物学センター、ノースウェスタン大学、イリノイ州エバンストン、米国

ジェヨン・K・ユング、クロエ・M・アーチュレッタ、ジュリアス・B・ラックス

米国イリノイ州エバンストン、ノースウェスタン大学水研究センター

ジェヨン・K・ユング、クロエ・M・アーチュレッタ、ジュリアス・B・ラックス

Stemloop, Inc.、米国イリノイ州エバンストン

ハリド・K・アラム＆ジュリアス・B・ラックス

米国イリノイ州エバンストン、ノースウェスタン大学、学際的生物科学大学院プログラム

ジュリアス・B・ラックス

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JKJ、KKA、JBL が研究を設計しました。 JKJ、CMA、JBLがデータを分析した。 JKJ、CMA、KKAが調査を実施した。 JKJ、KKA、JBL が方法論を開発しました。 JKJとJBLはデータの可視化に取り組みました。 JKJ と CMA がソフトウェアを開発しました。 JKJ、KKA、CMA、JBL が記事を執筆しました。 JKJ と JBL がデータを厳選しました。 JBLは研究のための資金を獲得した。 JKJ と CMA は結果を検証しました。 JKJ と JBL が研究を管理、調整しました。 JKJとJBLが研究を監督しました。

ジュリアス・B・ラックスへの通信。

KKA、JKJ、および JBL は、規制されたインビトロ転写反応に関する国際特許出願 (No. US 17/309,240) およびヨーロッパ (No. EP19881824.7) を国有化された国際特許出願 (PCT) を提出しました。 /US2020/030112、第 62/838,852 号）は、インビトロ転写反応の保存と安定化に関するものであり、 DNA鎖置換回路。 KKA と JBL は Stemloop, Inc. の創設者であり、金銭的利害関係を持っています。後者の利害関係は、利益相反ポリシーに従ってノースウェスタン大学によって検討および管理されます。 CMA は競合する利益はないと宣言します。

Nature Chemical Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Jerome Bonnet と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a, IVT コンポーネントの存在下では、T7 RNAP は DNA シグナル ゲートのトーホールド領域に非特異的に結合できます。 トーホールドがゲートの 3' 末端にある場合、クエンチャー鎖を置き換える可能性がある不要な RNA 副産物の転写が引き起こされます。 このプロセスは、トーホールドがゲートの 5' 端にある場合にはブロックされます。 b. 3' トーホールド DNA シグナル ゲートは、T7 RNAP の存在下で蛍光活性化を引き起こしますが、5' トーホールド DNA シグナル ゲートは活性化しません。 c. b からの反応生成物を抽出し、尿素ポリアクリルアミドゲルで泳動すると、RNA 副生成物は 3' トーホールド DNA シグナル ゲートからのみ現れます。 反応中に DNA シグナルゲートが存在しないネガティブコントロール (-) を、3' および 5' の両方のトーホールドに対して並行して実行しました。 d. 2'-O-メチル オリゴヌクレオチドによる DNA ゲートの修飾により、T7 RNAP によるプロモーター非依存性の転写が防止されます。 e. 3' トーホールド DNA シグナル ゲートが 2'-O-メチル オリゴヌクレオチドで修飾される場合、T7 RNAP 駆動の IVT テンプレートの非存在下では蛍光活性化は観察されません。 f、eからの反応を尿素ポリアクリルアミドゲル上で実行した場合、2'-O-メチルDNAシグナルゲートからRNA副産物は観察されませんでした。 反応中に DNA シグナルゲートが存在しないネガティブコントロール (-) を、未修飾ゲートと修飾ゲートの両方に対して同時に実行しました。 b および e に示すデータは、n = 3 の独立した生物学的複製であり、それぞれ MEF (μM フルオレセイン) に標準化された生の蛍光を線としてプロットしています。 陰影は、反復の平均±標準偏差を示します。 c および f に示すデータは、n = 3 の独立した生物学的複製の代表です。 c と f に示すトリミングされていない未処理のゲル画像は、ソース データとして利用できます。

ソースデータ

a、図2aの各InvadeR変異体の最初に転写された8つのヌクレオチド。 InvadeR 配列の一部ではないヌクレオチドは太字で、挿入されたヌクレオチドには下線が付けられています。 b、Qubit RNA HS アッセイキット (Invitrogen、カタログ番号 Q32852) によって測定された、IVT 反応からの各バリアントの濃度。 各バリアントは、DNA シグナル ゲートの存在下で 30 分間 in situ で生成され、抽出されました (「材料と方法」の「IVT 反応からの RNA 抽出」セクションを参照)。 バリアント 1 の濃度は、Qubit の定量化には低すぎました。 c、bで測定したサンプルを尿素ポリアクリルアミドゲル上で泳動し、SYBRゴールドで染色しました。 同様の長さの RNA 標準の滴定を実行して、Fiji-ImageJ56 によって定量化されたバンド ピーク面積の直線範囲を決定しました。 d. ロードされた標準の総量に対して、Fiji-ImageJ 定量化から計算されたピーク面積をプロットすることにより、検量線を作成しました。 e. d の検量線を使用して、各バリアントの RNA の総量を決定し、b で Qubit によって行われた測定値と比較しました。 b のデータは、n = 3 の独立した生物学的複製について示されており、それぞれが平均を表すバーの高さを持つ点としてプロットされています。 エラーバーは、反復の平均±標準偏差を示します。 c に示すデータは、n = 3 の独立した生物学的複製の代表です。 c に示すトリミングされていない未処理のゲル画像は、ソース データとして利用できます。

ソースデータ

InvadeR をコードする DNA テンプレートは、T7 プロモーター、その後に 2 bp スペーサーおよび InvadeR 配列の上流にある aTF オペレーター配列を含むように修飾されます。 a、GG-tetO-InvadeR、b、GG-ttgO-InvadeR、c、GA-smtO-Hairpin2-InvadeR (1BP スペーサーバリアント) の二次構造、最小自由エネルギー、塩基対形成確率は、37 °C で NUPACK を使用して予測されます30。 GA-smtO-Hairpin2-InvadeR 配列には、smtO による InvadeR の構造干渉を最小限に抑えるように設計されたヘアピンが含まれています（拡張データ図 4h、i）。 信号ゲートに相補的なシーケンスは点線で示され、緑色の陰影で強調表示されます。 d、TetR はテトラサイクリンを感知するために使用されます。 e、MarR ファミリー aTF である TtgR は、ナリンゲニンを感知するために使用されます。 f、SmtB は亜鉛を感知するために使用されます。 活性化反応速度の変動は、InvadeR の予測二次構造が誘導速度に影響を与える傾向と一致しています。 各センサーの検出限界を評価するために、g、テトラサイクリン、h、ナリンゲニン、および i、ZnSO4 の用量反応曲線を作成しました (1 時間のエンドポイント データ)。 示されているすべてのデータは、n = 3 の独立した生物学的複製であり、それぞれが線 (d – f) または点 (g – i) としてプロットされており、生の蛍光値は MEF (μM フルオレセイン) に標準化されています。 陰影 (d – f) とエラーバー (g – i) は、反復の平均 ± 標準偏差を示します。 シグナルがバックグラウンドから区別できるリガンド濃度は、リガンドなし条件に対する両側不均一分散スチューデント t 検定を使用して決定され、その P 値の範囲はアスタリスクで示されます (***P < 0.001、*) *P = 0.001 ～ 0.01、*P = 0.01 ～ 0.05)。 正確な P 値と自由度はソース データにあります。 X 軸は対数スケールであり、ソース データに示されているため、リガンドなし条件のデータは除外されました。

ソースデータ

a、37℃でNUPACKによって予測されたGA-smtO-InvadeRの二次構造、最小自由エネルギーおよび塩基対形成確率30。 野生型 smtO 配列の一部は、InvadeR と強力な予測ステムループを形成します。 緑色で強調表示されたヌクレオチドは、DNA シグナル ゲートを鎖置換する InvadeR 配列に対応します。 b、37℃でNUPACKによって予測されたGA-smtO-InvadeR-InvadeRの二次構造、最小自由エネルギーおよび塩基対形成確率30。 c、制御されていないGA-smtO-InvadeR反応と制御されていないGA-smtO-InvadeR-InvadeR反応の動態の比較。 d、e、smtO配列を隔離し、InvadeRへの結合を防ぐように設計された2つのGA-smtO-Hairpin-InvadeRバリアントのNUPACK予測二次構造、最小自由エネルギーおよび塩基対形成確率。 灰色で強調表示されたヌクレオチドは、追加された隔離配列を示します。 f、dおよびeに示される変異体の無制御反応の速度論の比較。 g、GA-smtO-Hairpin2-InvadeR バリアントは、ステムの長さ、またはヘアピンと InvadeR 配列の間のスペーサーのいずれかを長くすることによって構築されました。 ステム長バリアントは 0 nt スペーサーを使用して構築され、スペーサー バリアントは 12 bp ステム長を使用して構築されます。 h、i、GA-smtO-Hairpin2-InvadeR バリアントの制御されていない反応速度論の比較。 示されているすべてのデータは、n = 3 の独立した生物学的複製であり、それぞれが MEF (μM フルオレセイン) に標準化された生の蛍光値とともに線としてプロットされています。 陰影は、反復の平均±標準偏差を示します。

ソースデータ

図３〜図６で論じた論理ゲートのシミュレーション。 図 4、5、および拡張データ図 7 は、予想されるシミュレーション軌道の傾向とともに示されています。 結果のシミュレーションに使用されるすべての Jupyter ノートブック コードは補足データ 6 として利用でき、各代表的な論理ゲートの ODE モデルを開発するために使用される方法については補足情報で説明されています。

ソースデータ

a、図 4c に示す DNA AND ゲートのシーケンスと設計。 不一致は、反応を前進させるための熱力学的ドライバーとして機能します。 クランプ ドメインは、入力 1 (オレンジ) のみでトップ ストランドがストランド置換されるのを防ぎます。 b. 熱力学ドライバーがないと、信号は観察されません。 クランプを長くすると、入力 1 によるリークが減少します。リークは、ac、3-bp、d、5-bp、および e、7-bp クランプから観察されます。 f, オペレーター配列を含まない InvadeR および RNA NOT ゲートの配列と設計。 InvadeR とシグナル ゲート間の不一致は赤色で強調表示されます。 バリアント 2 には、NOT ゲートとの相互作用を強化する 6 つの追加のアデニンが組み込まれています。 NOT ゲート 1 には 4 nt のトーホールドがあり、NOT ゲート 2 および 3 には 6 nt のトーホールドがあります。 NOT ゲート 3 には、転写効率を高める開始グアニンの後に追加のアデニンがあります 36。 InvadeR g、バリアント 1 および h、バリアント 2 をコードするテンプレート 25 nM の存在下で、NOT ゲート 1 をコードするテンプレートの滴定。バリアント 2 はシグナルをブロックするためにより多くの NOT ゲート テンプレートを必要としますが、バリアント 2 からはより強いシグナルが観察されます。 NOTゲートなし。 25 nMのInvadeRバリアント2テンプレートの存在下でのNOTゲートi、2およびj、3をコードするテンプレートの滴定。 NOT ゲート 2 および 3 は、NOT ゲート 1 よりも InvadeR を隔離するのに効率的です。 k、演算子シーケンスを NOT ゲートに組み込むと、その構造に影響を与えます。 NUPACK は、smtO シーケンス (薄灰色) が NOT ゲート 3 の一部と相互作用し、toehold30 をブロックすると予測します。 スペーサー配列 (下線) により、予想される NOT ゲートの構造を復元できます。 25 nM の InvadeR バリアント 2 テンプレートの存在下で、l、smtO – NOT ゲート 3 および k、smtO – スペーサー – NOT ゲート 3 をコードするテンプレートの滴定。 示されているすべての反応は規制されていません。 示されているすべてのデータは、n = 3 の独立した生物学的複製であり、それぞれが MEF (μM フルオレセイン) に標準化された生の蛍光を線としてプロットしています。 陰影は、反復の平均±標準偏差を示します。

ソースデータ

a、図4eに示すテトラサイクリン誘発NOTゲート。 b. TetR 調節 NOT ゲートのシャッフルされたシーケンスをコード化するテンプレートをコントロールとして使用し、テトラサイクリン誘発シグナルの減少がリソースの制限によるものではないことを実証しました。 c、ZnSO4 誘起 NOT ゲートも同じ方法で設計できます。 スペーサー配列は、smtO 配列が NOT ゲート構造を破壊するのを防ぐために追加されました (拡張データ図 6)。 d. ZnSO4 の存在下では、蛍光シグナルが失活します。 同様に、SmtB 調節 NOT ゲートのシャッフル配列をコードするテンプレートを使用した対照反応を示します。 e、図 5c で説明したように設計された tet IMPLY ZnSO4 ゲート。 f, テトラサイクリンのみを添加しない限り、蛍光活性化が観察されます。 g、tet IMPLY ZnSO4 ゲートは、OR ゲートの代わりにシグナル ゲートと相互作用する ZnSO4 誘導性テンプレートを含めることによって構築することもできます。 h, 代替 IMPLY ゲートは、予期された論理計算を実行します。 ZnSO4 誘発 RNA 鎖がシグナル ゲート上で TMSD を直接実行するため、ZnSO4 誘発条件からのより速いシグナル生成が観察されます。 i、IMPLY ゲートを構築する別のアプローチは、ZnSO4 IMPLY tet ゲートに適用でき、j、ゲートは期待される論理計算を実行します。 k、tet NIMPLY ZnSO4 ゲートは、図 5g に示す ZnSO4 NIMPLY tet ゲートと同じ方法で設計されています。 l、tet NIMPLY ZnSO4 ゲートは、期待される論理計算を実行します。 この図で使用されるすべての実験条件は補足データ 5 にあります。示されているすべてのデータは、MEF (μM フルオレセイン) に標準化された生の蛍光を線としてプロットした n = 3 の独立した生物学的複製です。 陰影は、反復の平均±標準偏差を示します。

ソースデータ

図6eに示すデータに対応する速度論的トレースは、固定シグナルゲート濃度（a、0X、b、1X、c、2Xおよびd、3X閾値）を超えるさまざまな比率で8nt閾値ゲートについて示されています。 ヒートマップが作成された時点 (t = 100 分) は縦の点線で示されます。 亜鉛濃度の違いによる応答速度の違いは、標準を作成する上で不可欠です。 e, 10 μM および 30 μM の亜鉛条件では、閾値ゲートなしでは速度論的な差異は示されません。 f、g、それぞれ図6e、dからの100分でのADC回路の機能特性とODE予測。30μM亜鉛および4X閾値条件を含みます。 10 μM および 30 μM の亜鉛条件は、e で観察された同一の速度論的挙動により、ODE モデルによって予測されたとおりに同一に挙動します。 h、fに示す半定量標準の対応する棒グラフデータ。 示されているすべてのデータは、n = 3の独立した生物学的複製であり、それぞれが線（a〜e）または点（h）としてプロットされており、MEF（μMフルオレセイン）に標準化された生の蛍光値が示されています。 h のバーと f のヒートマップ上の値は、反復の平均を表します。 a ～ e の網掛けと h のエラーバーは、反復の平均 ± 標準偏差を示します。

ソースデータ

別途指示がない限り、非調節反応物を凍結保護剤として50 mM スクロースおよび250 mM D-マンニトールを添加して一晩凍結乾燥した。 次に、凍結乾燥した反応物をドライカード付きの遮光袋に真空包装し、使用するまで涼しい日陰の場所に保管しました（詳細なプロトコルについては、「材料と方法」を参照）。 a、1 日間、b、4 日間、および c、7 日間の保存後の再水和反応の速度追跡を示します。 時間の経過とともに、全体的な信号と応答速度が低下します。 経時的なシグナル損失の原因を調査するために、DNAシグナルゲートのみを凍結保護剤の有無にかかわらず一晩凍結乾燥し、上記のように包装して保管しました。 d、1日、e、4日、f、7日後に、DNAシグナルゲートを残りのIVTコンポーネントで再水和させた。 応答速度と信号の大きさは維持されており、信号損失が特定の IVT コンポーネントの不安定性によるものである可能性が高いことを示しています。 この仮説を検証するために、NaOH 緩衝 NTP の代わりに Tris 緩衝 NTP を用いた制御されていない反応を凍結保護剤とともに凍結乾燥し、上記のようにパッケージ化して保管しました。 g、1 日、h、4 日、および i、7 日間の保存後の再水和反応の速度論的追跡が示されています。 シグナル損失は、トリス緩衝 NTP を使用するとある程度軽減されますが、凍結乾燥反応物の長期保存でも同程度のシグナル損失が観察されます。 示されているすべてのデータは、n = 3 の独立した生物学的複製であり、それぞれが MEF (μM フルオレセイン) に標準化された生の蛍光値とともに線としてプロットされています。 陰影は、反復の平均±標準偏差を示します。

ソースデータ

拡張データ図4bに示されているsmtO-InvadeR-InvadeRを使用するTMSD反応を用いた亜鉛センシングROSALINDは、凍結乾燥され、a、水道水、およびb、さまざまな濃度のZnSO4を添加したミシガン湖水で再水和されました。 次いで、反応物を 37 °C で 1 時間インキュベートし、蛍光を特徴付けました。 水サンプルの種類ごとに、同量の ZnSO4 を添加した実験室グレードの水で再水和した反応のシグナルと比較しました。 いずれの場合も、反応は予想どおりに動作し、濾過された水サンプルと濾過されていない水サンプルの間でシグナルに違いは見られませんでした。 ただし、実際の水サンプルでは、​​ZnSO4 を添加した実験室グレードの水で再水和したサンプルと比較して、おそらくマトリックス効果のため、わずかな信号の減少が観察されます。 示されているすべてのデータは、n = 3 の独立した生物学的複製であり、それぞれが MEF (μM フルオレセイン) に標準化された生の蛍光値を持つ点としてプロットされています。 各バーの高さは反復の平均を表し、エラーバーは反復の平均 ± 標準偏差を示します。

ソースデータ

補足図。 1 ～ 5 およびこの研究で使用された ODE モデリングの方法。

この研究で使用された DNA およびタンパク質の配列。

生尿素-PAGEゲル画像を補足図2dに示します。

補足図の校正済みプレートリーダーデータ。

この研究で構築されたすべての論理ゲートの設計とシーケンス、およびそのソース。

すべての論理ゲートに使用される実験条件 (リガンド、aTF、DNA テンプレート、および DNA ゲート濃度)、および ODE シミュレーションに使用されるそれらの速度論パラメーター。

拡張データ 5、拡張データ 8、および図 6 に示す結果をシミュレートするために使用される Jupyter ノートブック コード。

図 2 の校正済みプレート リーダー ソース データ。

図 3 の校正済みプレート リーダー ソース データ。

図4の校正されたプレートリーダーのソースデータ。

図5の校正済みプレートリーダーソースデータ。

図6の校正済みプレートリーダーソースデータ。

拡張データ用の校正済みプレート リーダー ソース データ 図 1。

拡張データ図 1 に示す未処理、未クロップの尿素 – PAGE ゲルとその簡単な説明。

拡張データ用の校正済みプレート リーダー ソース データ 図 2。

拡張データ図 2 に示す未処理、未クロップの尿素 – PAGE ゲルとその簡単な説明。

拡張データ用の校正済みプレートリーダーソースデータ 図 3.

拡張データ用の校正済みプレートリーダーソースデータ 図 4.

拡張データ用の校正されたプレートリーダーのソースデータ 図 5.

拡張データ用の校正されたプレートリーダーのソースデータ 図 6.

拡張データ用の校正されたプレートリーダーのソースデータ 図 7。

拡張データ用の校正されたプレートリーダーのソースデータ 図 8。

拡張データ用の校正されたプレートリーダーのソースデータ 図 9。

拡張データ用の校正されたプレートリーダーのソースデータ 図 10。

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転載と許可

Jung、JK、Archeleta、CM、Alam、KK 他 DNA鎖変位回路を備えたセルフリーバイオセンサーのプログラミング。 Nat Chem Biol 18、385–393 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41589-021-00962-9

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受信日: 2021 年 1 月 29 日

受理日: 2021 年 12 月 16 日

公開日: 2022 年 2 月 17 日

発行日：2022年4月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41589-021-00962-9

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